Die Isolierung von Zellen ist ein üblicher Prozess, der in vielen Biologie-Klassen und Laboratorien durchgeführt wird. Da Herzkrankheiten weltweit verbreitet sind, untersuchen derzeit viele Laboratorien das Herz. Die Isolierung von Herzzellen ist ein einfacher Prozess, der leicht zu erlernen ist.

Teil eins von fünf:
Vorbereiten der Lösungen

  1. 1 Stellen Sie einen Perfusionspuffer her. Der Perfusionspuffer ist die Basis aller Lösungen, die beim Isolationsprozess verwendet werden. Der Puffer enthält nur zugesetzte Glucose. Die Glukose liefert eine Energiequelle für die Zellen, während sie ex vivo sind.
    • Messen Sie 500 ml des 1 x Perfusionspuffers (PB) in einem Messzylinder.
    • Gieße den PB in ein 600 ml Becherglas.
    • Gebe der Lösung 0,500 g Glucose zu.
    • Stellen Sie den Becher auf eine Rührplatte.
    • Setzen Sie einen Magnetrührstab auf den Boden des Bechers.
    • Schalte die Rührplatte an und rühre die Lösung, bis die gesamte Glucose gelöst ist.
  2. 2 Machen Sie eine Stop-Lösung. Die Zellen werden später in die "Stop-Lösung" gesetzt, wodurch das Enzym daran gehindert wird, die Zellen weiter abzubauen.
    • Trennen Sie 18 ml PB in ein 50 ml Falcon-Röhrchen.
    • Gebe 2 ml Fetales Rinderserum (FBS) zu der Lösung hinzu.
    • Gebe 25 ul 10 mM CaCl & sub2; zu der Lösung hinzu.
    • Drehen Sie die Falcon-Tube dreimal hin und her, um die Lösung zu mischen.
  3. 3 Stellen Sie eine Perfusionslösung her. BDM ist ein Cross-Bridge-Inhibitor, der verhindert, dass Zellen kontrahieren oder schlagen, und wird verwendet, um die Gesundheit und Struktur von Zellen zu erhalten. Perfusionslösung ist Perfusionspuffer mit hinzugefügtem BDM.
    • In dem verbleibenden PB werden 0,463 g 2,3-Butadien-Monoxid (BDM) zugegeben.
    • Rühre die Lösung auf einer Rührplatte, bis das BDM vollständig gelöst ist.
  4. 4 Mache einen Verdauungspuffer. Kollagenase ist ein Enzym, das spezifisch Kollagen im Herzen abbaut, das Herzzellen aus dem Gewebe freisetzt.
    • Trenne 150 ml Perfusionslösung in ein 250 ml-Becherglas.
    • Gebe 32 ul 100 mM CaCl & sub2; zu der Lösung hinzu.
    • Gebe 0,100 Gramm Collagenase vom Typ II zu der Lösung hinzu.
    • Rühre die Lösung auf einer Rührplatte, bis die Kollagenase vollständig gelöst ist.

Teil Zwei von Fünf:
Die Kanülierung durchführen

  1. 1 Richten Sie die Kanüle ein.
    • Machen Sie eine Kanüle, indem Sie einen halben Zoll von der Spitze einer Nadel abschneiden.
    • Schrauben Sie die Kanüle in den Boden einer 5 ml Spritze.
    • Füllen Sie die 5-ml-Spritze mit Perfusionslösung.
    • Füllen Sie ein Wägeschiffchen mit Perfusionslösung.
    • Legen Sie das Ende der Kanüle in das gefüllte Wägeboot.
    • Schleife zwei gebundene Nähte um den Boden der Kanüle.
  2. 2 Cannulate das Herz. Die Aorta ist die Hauptarterie des Herzens, die sauerstoffreiches Blut an das Kreislaufsystem liefert.
    • Mit zwei Pinzetten das extrahierte Rattenherz in die Wiege legen.
    • Ziehen Sie die Aorta nach oben und über das Ende der Kanüle.
    • Binde zwei Nähte um die Aorta und befestige das Herz an der Kanüle.

Teil Drei von Fünf:
Durchführen einer Langendorff-Perfusion

  1. 1 Richten Sie das Langendorff-System ein. Das Langendorff-Perfusionssystem verwendet eine retrograde Perfusion, die die Flüssigkeit in die Aorta in das Herz drückt, wo der Verdauungspuffer das Herzgewebe abbaut, um die Zellen freizusetzen.
    • Füllen Sie eine 60 ml Spritze mit 50 ml Perfusionslösung.
    • Füllen Sie eine weitere 60-ml-Spritze mit 60 ml Digest-Puffer.
  2. 2 Perfundiere das Herz. Das Herz sollte nach der Verdauung eine helle Fleischfarbe haben.
    • Schrauben Sie die Kanüle in den Boden des Langendorff-Systems.
    • Direkter Fluss der Perfusionslösung zum Herzen, bis das Herz klare Flüssigkeit tropft.
    • Direkter Fluss des Digestpuffers zum Herzen.
    • Halten Sie den Digest-Puffer so lange flüssig, bis das Herz weich wird, was etwa 10 bis 12 Minuten dauert.

Teil vier von fünf:
Durchführen der Dissektion

  1. 1 Entfernen Sie das Herz von der Kanüle. Die keramisch beschichtete Schere verhindert eine Destabilisierung der Membran im Herzen, die zum Zelltod führen könnte.
    • Entfernen Sie die Kanüle aus dem Perfusionssystem und auf ein Papiertuch.
    • Schneiden Sie mit einer Keramik beschichteten Schere und einer Pinzette die Oberseite des Herzens ab, um es aus der Kanüle zu entfernen.
  2. 2 Teilen Sie das Herz in drei Abschnitte.
    • Halten Sie das Herz mit einer Pinzette, schneiden Sie mit einer Schere den rechten Ventrikel (RV), die intraventrikuläre Wand (IV) und den linken Ventrikel (LV).
    • Der LV wird das größte Stück sein und der RV wird das kleinste Stück sein.

Teil fünf von fünf:
Die Zellen isolieren

  1. 1 Stellen Sie die Becher in einem Wasserbad auf. Die Aufrechterhaltung einer physiologischen Temperatur verhindert die Degradation von Gewebe und Zellen.
    • Füllen Sie sechs 5-mL-Bechergläser mit 750 uL Digest-Puffer und legen Sie sie in ein 37 Grad Celsius Wasserbad.
    • Beschrifte jeden Becher entsprechend dem Ort, an dem er entnommen wurde, entweder vom RV, IV oder LV. Es sollte 2 Becher für jedes RV, IV und LV geben.
  2. 2 Erwerben Sie die Zellen. Die Trübung der Lösung zeigt an, dass Zellen aus dem Gewebe freigesetzt wurden.
    • Legen Sie jedes Gewebestück in einen der beschrifteten Bechergläser.
    • Mit einer Keramik beschichteten Schere das Gewebe vorsichtig auseinanderziehen.
    • Legen Sie eine geschlossene Schere in die Mitte des Gewebes.
    • Verschieben Sie die Scherenblätter, um eine X-Position zu bilden.
    • Wiederholen Sie die Bewegung und verlängern Sie die Klingen von Seite zu Seite, bis der Digest-Puffer im Becherglas trüb wird.
  3. 3 Übertragen Sie die Gewebestücke auf den zweiten Bechersatz.
    • Verwenden Sie keramikbeschichtete Pinzetten, übertragen Sie die gehäkelten Gewebestücke in den zweiten Satz beschrifteter Bechergläser.
  4. 4 Übertragen Sie die Zellen in eine markierte Eppendorf-Röhrchen.
    • Beschriften Sie jedes Eppendorf-Röhrchen mit RV, IV oder LV. Es wird 6 LV-Röhren, 6 IV-Röhren und 6 RV-Röhren für insgesamt 18 Röhren geben.
    • Füllen Sie jedes Eppendorf-Röhrchen mit 750 μl Stopplösung.
    • Übertragen Sie die Lösung der Zellen im Becherglas des Verdauungspuffers in ein etikettiertes Röhrchen.
  5. 5 Wiederholen Sie den Vorgang. Denken Sie daran, dass insgesamt achtzehn Röhren verwendet werden.
    • Wiederholen Sie Teil 5, Schritte zwei, drei und vier für jedes Gewebestück sechs Mal.
  6. 6 Beenden Sie den Isolationsprozess.
    • Nachdem Sie die Zellen in ihre markierten Eppendorf-Röhrchen transferiert haben, ist der Zellisolierungsprozess abgeschlossen.
    • Gesunde Herzzellen sind gerade, lange Stäbchen mit klaren Streifen.
    • Tote Zellen werden zerknittert und kreisförmig sein.