Die Identifizierung von Bakterien ist ein komplexer Prozess. Dies liegt zum Teil daran, dass es so viele Arten gibt - Schätzungen der Artenzahl reichen von etwa 10.000 bis über eine Milliarde![1] In der Lage zu sein, Bakterien richtig zu identifizieren, ist besonders in der klinischen Umgebung wichtig, da eine geeignete Behandlung von der Art der Bakterien abhängen kann, die eine Infektion verursachen. In den meisten Fällen ist die Identifizierung von Bakterien ein Eliminationsprozess. Um Bakterien zu identifizieren, verwenden Sie Färbetechniken, notieren Sie das Aussehen der Bakterien und beobachten Sie, wie die Bakterien auf unterschiedliche Bedingungen reagieren. Um schnell die genaue Art der Bakterien zu bestimmen, senden Sie eine Probe für den DNA-Test.

Methode eins von vier:
Identifizieren von Bakterien mit Gramfärbung

  1. 1 Verwenden Sie Gram-Färbung, um zu sehen, ob Bakterien Gram-positiv oder Gram-negativ sind. Gram-Färbung ist ein Verfahren, mit dem Sie Bakterien in zwei Arten teilen können: Gram-positiv und Gram-negativ. Gram-positive Bakterien haben eine extra dicke Zellwand (aus einem Polymer namens Peptidoglycan), die eine Farbstofffärbung besser als die dünneren Zellwände von Gram-negativen Bakterien enthält.[2]
    • Gemeinsame Gram-positive Bakterien-Gattungen umfassen Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus und Listeria.[3]
    • Herkömmliche Gram-negative Bakteriengattungen umfassen Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacteriaceae, Haemophilus, Vibrio, Campylobacter und Fusobacterium.[4]
  2. 2 Verwenden Sie Sicherheitsvorkehrungen. Die Bakterien und Chemikalien, die Sie während eines Gram-Färbeverfahrens handhaben werden, sind potentiell gefährlich. Tragen Sie bei der Durchführung des Flecks eine Schutzbrille, Einweg-Nitrilhandschuhe und einen Laborkittel. Legen Sie Ihre Einmalhandschuhe und alle anderen kontaminierten Abfallmaterialien in einen Biogefährdungsbeutel, wenn Sie fertig sind. Befolgen Sie die Anweisungen Ihres Labors zur Entsorgung des Biohazard-Beutels.[5]
  3. 3 Machen Sie eine Rutsche Ihrer Bakterienprobe. Um den Prozess zu beginnen, legen Sie einen kleinen Tropfen oder ein Stück Ihrer Bakterienprobe auf einen sterilen Objektträger. Führen Sie den Objektträger dreimal durch die Flamme eines Bunsenbrenners, um die Probe zu erhitzen.[6] Dies verhindert, dass die Probe weggespült wird, wenn Sie Reagenzien hinzufügen oder den Objektträger spülen.
  4. 4 5 Tropfen Kristallviolett auf den Objektträger geben. Die Tropfen des Kristallviolett-Farbstoffs auf die hitzefixierte Kultur geben. Lassen Sie die Probe für 1 Minute in den Kristallviolett-Farbstoff einweichen.[7]
    • Um ein Verfärben der Hand zu vermeiden, möchten Sie vielleicht die Folie mit einer Wäscheklammer an Ort und Stelle halten.[8]
  5. 5 Spülen Sie den Objektträger vorsichtig aus, um den Fleck zu entfernen. Verwenden Sie einen sehr sanften Wasserstrahl aus einer Spüle oder einer Spritzflasche. Spülen Sie nicht länger als 5 Sekunden.[9] Dieser Prozess entfernt alle Farbstoffe, die nicht an die Probe gebunden sind.
  6. 6 5 Tropfen Gram's Jod auf die Folie geben. Gram's Jod ist eine Lösung von Jod, Kaliumjodid und Natriumbicarbonat.[10] Diese Lösung wird bewirken, dass der Kristallviolett-Farbstoff mit den Zellwänden der Bakterien verschmolzen wird. Fügen Sie ungefähr 5 Tropfen hinzu und lassen Sie es für 1 Minute sitzen.[11]
  7. 7 Spülen Sie die Probe mit Alkohol oder Aceton. Alkohol und Aceton sind Entfärbungsmittel. Wenn Ihre Bakterien ein Gram-negativer Stamm sind, werden diese Mittel den Fleck von den bakteriellen Zellwänden entfernen. Lassen Sie ein paar Tropfen des Entfärbungsmittels über die Probe rieseln und lassen Sie sie nicht länger als 3 Sekunden stehen. Vorsichtig mit Wasser für nicht mehr als 5 Sekunden spülen, um den Alkohol oder Aceton zu entfernen.[12]
    • Wenn Sie das Entfärbungsmittel zu lange auf der Probe liegen lassen, kann es den Fleck aus Gram-positiven Bakterien entfernen, was zu einem falschen Gram-negativen Ergebnis führt.
  8. 8 Gegenfärbung der Lösung mit Safranin. Safranin ist ein roter Farbstoff, der als Gegenfärbung zum Kristallviolett wirkt und alle Bakterien anfärbt, die den violetten Fleck nicht enthalten. Geben Sie etwa 5 Tropfen Safraninlösung in die Probe und lassen Sie sie 1 Minute stehen. Spülen Sie sehr vorsichtig mit Wasser für 5 Sekunden.[13]
  9. 9 Betrachten Sie Ihre Probe unter dem Mikroskop bei 1000-facher Vergrößerung. Wenn die Bakterien ein Gram-positiver Stamm sind, erscheinen sie unter dem Mikroskop violett oder violett. Gram-negative Bakterien erscheinen aus der Safranin-Gegenfärbung rot.[14]

Methode zwei von vier:
Mit der Ziehl-Neelsen Maltechnik

  1. 1 Verwenden Sie Ziehl-Neelsen-Färbung, um säurefeste Bakterien zu erkennen. Säurefeste Bakterien enthalten eine höhere Menge an Lipiden als andere Arten von Bakterien, wodurch sie gegenüber den Färbemitteln resistent sind, die bei der Gram-Färbung verwendet werden. Säurefeste Bakterien gehören zur Gattung Mycobacterium, zu der auch das Tuberkulose verursachende Bakterium (M. tuberculosis) gehört. Säurefeste Bakterien können mit einem roten Carbol-Fuchsin-Farbstoff gefärbt werden, der nicht mit einer sauren Alkohol- oder Schwefelsäurelösung ausgespült werden kann.[15]
  2. 2 Treffen Sie geeignete Sicherheitsvorkehrungen. Die Chemikalien und biologischen Materialien, die während eines Ziehl-Neelsen-Färbeverfahrens verwendet werden, können gefährlich sein. Sie werden auch Wärmequellen wie einen Bunsenbrenner, eine Spirituslampe oder einen elektrischen Heizstrahler verwenden. Berücksichtigen Sie beim Ausführen dieses Verfahrens die folgenden Vorsichtsmaßnahmen:[16]
    • Tragen Sie eine Schutzbrille, Nitrilhandschuhe und einen Laborkittel.[17]
    • Achten Sie darauf, dass Sie keine Dämpfe aus den Flecken- und Entfärbungslösungen einatmen oder auf die Haut oder in die Augen gelangen. Offene Behälter unter einem Abzug aufbewahren.[18]
    • Seien Sie vorsichtig beim Erhitzen Ihres Objektträgers, da viele der Chemikalien, die Sie verwenden, brennbar sind. Es kann auch Spuren von brennbaren Chemikalien auf Objektträgern und anderen Geräten geben.[19]
  3. 3 Bereiten Sie eine Folie vor. Verteilen Sie einen Abstrich Ihrer Probe mit kreisenden Bewegungen gleichmäßig über die Mitte eines sterilen Objektträgers. Ihr Abstrich sollte etwa 10 mm (0,4 Zoll) mal 20 mm (0,8 Zoll) betragen.[20]
  4. 4 Trockne deine Folie. Legen Sie den Objektträger auf einen Trockenständer mit der Schmierseite nach oben. Lassen Sie es für 30 Minuten an der Luft trocknen.[21] Versuchen Sie nicht, den Objektträger trocken zu tupfen.
  5. 5 Hitze fixiere deinen Abstrich. Sie können die Probe erhitzen, indem Sie den Objektträger 2-3 Mal mit der Schmierseite nach oben über die Flamme eines Bunsenbrenners führen.Legen Sie den Objektträger alternativ auf einen elektrischen Objektträgerwärmer bei 65 ° -75 ° C (149 ° -167 ° F) für mindestens 2 Stunden.[22] Achten Sie darauf, die Probe nicht zu verbrennen oder zu kochen.
  6. 6 Füge Karbol-Fuchsin-Färbung zu deinem Dia hinzu. Geben Sie einige Tropfen Carbol-Fuchsin-Lösung auf den Objektträger. Fügen Sie genug hinzu, um den Abstrich vollständig abzudecken.[23]
  7. 7 Erhitze den gefärbten Objektträger, um den Fleck auf dem Abstrich zu fixieren. Erhitze den Objektträger vorsichtig über einen Bunsenbrenner oder eine Spirituslampe mit der Schmierseite nach oben oder lege ihn auf einen elektrischen Objektträgerheizer. Erhitze den Objektträger bis zum Erreichen von 60 ° C (140 ° F). Sie sollten sehen, dass der Dampf zu steigen beginnt. Lassen Sie den erhitzten Fleck für 5 Minuten auf dem Objektträger sitzen.[24]
    • Wenn Sie einen elektrischen Objektträgerwärmer verwenden, stellen Sie ihn auf 60 ° C (140 ° F) ein. Wenn Sie einen Bunsenbrenner oder eine Spirituslampe verwenden, müssen Sie sorgfältig auf das Erscheinen von Dampf oder Dampf achten.
    • Um den Objektträger für volle 5 Minuten auf der gewünschten Temperatur zu halten, wenden Sie Wärme intermittierend an.[25]
    • Achten Sie darauf, dass Sie Ihren fleckigen Ausstrich nicht kochen, verbrennen oder vollständig austrocknen.
  8. 8 Spülen Sie den Objektträger mit kaltem Wasser. Lassen Sie den Objektträger etwa 5 Minuten lang abkühlen und spülen Sie ihn anschließend einige Sekunden lang mit sauberem Wasser aus einem Wasserhahn oder einer Quetschflasche, um Flecken zu entfernen, die nicht mit der Probe verbunden sind.[26]
  9. 9 Bedecken Sie den Abstrich mit saurem Alkohol oder Schwefelsäure. Fügen Sie genügend 3% Volumen über Volumen (v / v) Säure Alkohol oder 20% Schwefelsäure hinzu, um den Abstrich vollständig zu bedecken. Lassen Sie die Säure auf der Folie, bis der Fleck zu einem sehr blass rosa verblasst ist.[27] Dies dauert in der Regel mindestens 10 Minuten.[28]
  10. 10 Spülen Sie den Objektträger mit klarem Wasser ab. Spülen Sie vorsichtig mit Wasser aus einem Wasserhahn oder einer Flasche, wobei Sie darauf achten, dass Sie die Säure und alle verbleibenden Farbspuren wegwaschen.[29]
  11. 11 Fügen Sie der Folie Gegenfärbung hinzu. Sobald der Objektträger gespült ist, bedecken Sie den Fleck mit Malachitgrün oder Loefflers Methylenblau-Lösung. Diese Lösungen erzeugen einen grünen oder blauen "Hintergrund", der die rotgefärbten Bakterien hervorhebt und auch jedes andere biologische Material auf dem Objektträger anfärbt (wie menschliche Zellen und Bakterien, die nicht säurefest sind). Lassen Sie den Fleck 1-2 Minuten stehen.[30]
  12. 12 Spülen und trocknen Sie die Folie. Waschen Sie den Objektträger vorsichtig mit sauberem Wasser, um überschüssige Gegenfärbung zu entfernen. Wenn Sie fertig sind, wischen Sie die Rückseite der Folie mit einem sauberen Tuch ab und legen Sie die Folie auf ein Gestell, um sie an der Luft trocknen zu lassen.[31]
  13. 13 Untersuchen Sie den Objektträger unter einem Mikroskop bei 1000-facher Vergrößerung. Säurefeste Bakterien sollten rot oder pink erscheinen. Nicht säurefeste Bakterien, nicht-bakterielle Zellen und der Hintergrund erscheinen blau oder grün.[32]

Methode drei von vier:
Bakterielle Erscheinung und Verhalten beobachten

  1. 1 Beobachten Sie die Form der Bakterien. Sobald Sie die Färbung verwendet haben, um festzustellen, ob Ihre Bakterien grampositiv, gramnegativ oder säurefest sind, ist es an der Zeit, die Art der Bakterien einzugrenzen. Der erste Schritt besteht darin, die Form (en) der Bakterien auf dem Objektträger zu beobachten. Die 3 häufigsten Formen sind Coccus (kugelförmig), Bacillus (stäbchenförmig) und Spirale.[33]
    • Zu all diesen Formen gibt es zahlreiche Variationen. Zum Beispiel können Coccusbakterien in verschiedenen Formationen auftreten, wie zum Beispiel fusionierte Paare (Diplococcus), Ketten, Cluster oder Gruppen von 4 (Tetraden).
  2. 2 Stellen Sie fest, ob die Bakterien aerob oder anaerob sind. Nehmen Sie 2 Proben der Bakterien und erstellen Sie 2 separate Kulturen. 1 Kultur sollte anaerob (ohne Sauerstoff) und die andere sollte aerob (mit Sauerstoff gewachsen) sein. Lagern Sie Ihre anaerobe Kultur in einer sauerstofffreien Umgebung bei 35 ° C (95 ° F) für mindestens 48 Stunden, bevor Sie versuchen, bakterielles Wachstum zu beobachten.[34]
    • Wenn Ihre Bakterien in der sauerstofffreien Umgebung wachsen, aber nicht unter Sauerstoff, sind sie anaerob.
    • Bakterien, die wachsen, wenn sie Sauerstoff ausgesetzt werden, aber nicht, wenn sie in einer sauerstofffreien Umgebung gehalten werden, sind aerob.
    • Bakterien, die in beiden Umgebungen wachsen können, werden als fakultative Anaerobier bezeichnet.
  3. 3 Führen Sie einen Motilitätstest durch, um herauszufinden, ob Ihre Bakterien beweglich sind. Bewegliche Bakterien können sich selbst bewegen, indem sie sich mit einer oder mehreren Flagellen fortbewegen. Motilität oder Bewegungsmangel kann ein wichtiger Faktor bei der Identifizierung eines Bakterienstammes sein.[35] Es gibt verschiedene Arten von Motilitätstests, aber der halbfeste Mediumtest ist am sichersten und am einfachsten zu lesen.
  4. 4 Erstellen Sie eine Kultur für Ihren Motilitätstest. Bereiten Sie eine Bakterienkultur in einer Nährbrühe vor. Bereiten Sie die Brühe gemäß den Anweisungen für Ihr bevorzugtes Nährmedium vor.[36]
  5. 5 Inokulieren Sie eine Tube halbfesten Motilitätsagar mit Ihrer Kultur. Eine sterile Impfnadel mit etwas Brühe einlegen. Stechen Sie die Nadel vorsichtig direkt in ein Röhrchen mit halbfestem Agar, das für Motilitätstests (wie TTC-Agar) formuliert wurde. Die Nadel sollte etwa 2/3 des Weges in den Agar gehen.[37]
    • Wenn Sie fertig sind, ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück und achten Sie darauf, die ursprüngliche "Stichlinie" nicht zu verletzen.
    • Inkubiere das Röhrchen 48 Stunden bei 30 ° C (86 ° F).[38]
  6. 6 Lesen Sie die Ergebnisse des Motilitätstests. Motilitätsagar wird rot, wenn es mit Bakterien in Kontakt kommt. Wenn Ihre Bakterien beweglich sind, wird eine rote oder rosa Farbe über den Agar diffundieren. Wenn sie nicht beweglich sind, sehen Sie nur die rote Farbe entlang der ursprünglichen Stichlinie.[39]

Methode vier von vier:
Alles zusammenfügen

  1. 1 Setze deine Beobachtungen zusammen. Um die Gattung der Bakterien einzugrenzen, müssen Sie die Informationen aus Ihren Flecken, Kulturen und Beobachtungen der Bakterienform kombinieren. Wenn Sie eine Kultur von einem Patienten testen, können Informationen über ihre Symptome auch nützlich sein, um das Feld einzugrenzen.[40]
    • Wenn Ihre Tests z. B. zeigen, dass Ihre Bakterien gramnegative, anaerobe, nicht bewegliche Bazillen sind, und sie mit Bauchschmerzen, Übelkeit und Erbrechen beim Patienten verbunden sind, handelt es sich wahrscheinlich um Bacteroides fragilis.[41]
  2. 2 Konsultieren Sie eine Datenbank von Bakterien. Da es so viele Arten von Bakterien gibt, ist es unmöglich, sie alle selbst zu erinnern oder zu erkennen. Sie werden wahrscheinlich ein klinisches Mikrobiologie-Lehrbuch oder eine Online-Datenbank konsultieren und nach Bakterien mit allen Eigenschaften Ihrer Probe suchen müssen.
    • Gute Online-Ressourcen zur Identifizierung von Bakterien sind das Pathosystems Resource Integration Center (patricbrc.org) und die Pathogenic Bacteria-Datenbank bei GlobalRPh (globalrph.com/bacterial-strains.htm).
  3. 3 Verwenden Sie Gentests, um die genaue Art der Bakterien zu bestimmen. In einigen Fällen kann es notwendig sein, die genaue Bakterienart zu identifizieren. Der schnellste und effektivste Weg ist das DNA-Testen. DNA-Tests sind auch hilfreich bei der Identifizierung von Bakterien, die traditionellen Formen der Kultivierung oder Färbung widerstehen.[42] Moderne mikrobielle DNA-Tests können sehr schnell durchgeführt werden, manchmal in nur 2 Stunden.[43]
    • Wenn Sie keinen Zugang zu einem Labor haben, das mikrobielle Genomsequenzierung durchführt, senden Sie eine Probe an eine spezialisierte Einrichtung, wie z. B. MIDI Labs oder CD Genomics.